测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算，如密度、折射率 、紫外吸收
、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算 ，如定氮、双缩脲反应 、染料结合反应
、酚试剂反应等

主要测定方法有：双缩脲法、染料结合法 、酚试剂法
、紫外分光光度法、水扬酸比色法 、折光法
、旋光法、近红外光谱法.

目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法
，是通过测总氮量来确定蛋白质含量的方法。

凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸 、生物碱、含氮类脂
、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一 ，可用于所有动 、植物食品的分析及各种加工食品的分析
，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍 ，是个经典分析方法[6] 。至今仍被作为标准检验方法.此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定

凯氏定氮法可分为全量法
、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量 、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少
，且有一套微量凯氏定氮器
。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间
、简化操作的问题 ，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛[4].

在理化实验室,检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法.接下来以大量的试验来比较微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小.

1.材料与方法：

1.1试验材料

1.1.1试验样品

面粉

1.1.2试验药品和试剂

所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水 。

硫酸铜；

硫酸钾；

浓硫酸；

40％氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；

4％硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至lOOmL；

0．1mol／L盐酸标准滴定溶液；

甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g／L)与甲基红乙醇溶液(1g／L)按1+2体积比混合
。

1.1.3仪器和设备：

实验室常规仪器及下列各项：

凯氏烧瓶：500mL；

可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；

铰肉机：

篦孔径不超过4nm；

组织捣碎机；

粉碎机；

研钵：玻璃或瓷质；

化学消化器
，

凯氏定氮仪，

空气滤过器

1.2试验方法

1.2.1微量凯氏定氮法

微量凯氏定氮法的原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化 ，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出
，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的1/10加碱蒸馏，使氨蒸出 ，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定[2] 。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量
。包括消化、蒸馏 、吸收
、滴定四个步骤

1.2.2全量凯氏定氮法

全量凯氏定氮法的原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化
，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 ，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的全部加碱蒸馏
，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定 。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量
。包括消化、蒸馏 、吸收
、滴定四个步骤

2 分析过程

试样制备：固体样品：取有代表性的样品至少200g ，用研钵捣碎、研细；不易捣碎 、研细的样品应切(剪)成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。粉状样品：取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细)
，混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀；固液体样品：按固、液体比例 ，取有代表性的样品至少200g
，用组织捣碎机捣碎，混合均匀；肉制品：取去除不可食部分
、具有代表性的样品至少200g ，用铰肉机至少铰两次，混合均匀 。上述试样应放入密闭玻璃容器中
，于4°C冰箱内贮存备用，尽快测定。

2.1微量凯氏定氮法的分析过程

2.1.1样品消化 :

步骤：准确称取一定量的样品 ，加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL 、玻璃珠数粒→小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入)
，轻轻摇匀，以45?斜支于有小孔的石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处) ，待内容物全部炭化
、泡沫停止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上)
，保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉，取下烧瓶、冷却→转移至100ml容量瓶中 ，加水定容

2.1.2 蒸馏与吸收：

按图安装好微量定氮蒸馏装置
。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处
，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性 ，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂
，将冷凝管下端插入液面以下 。准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液 ，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封
，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏
。指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min

牛奶中蛋白质含量的测定

1 、消化:精密称取大豆样品1.0g左右 ，放入干燥的250 ml消化管中
，加入0.4g CuSO4 7g K2SO4 10ml H2SO4先200'C炭化，待泡沫停止后提高温度到450'C ，加热至液体沸腾
，待瓶内液体呈蓝绿色透明后，再继续加热0.5h。

冷却后加入20ml水 ，移入100ml容量瓶中
，用少量水洗涤消化管2~3次，洗液合并于容量瓶中定容 。

2
、蒸馏:连接凯氏定氮装置 ，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处
，加甲基红指示剂数滴及数ml硫酸，保持水呈酸性
。加入数粒玻璃珠以防暴沸 ，调节火力加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、向吸收瓶内加入20g/L硼酸溶液20ml及混合指示剂2滴，并使冷凝管下端插入液面以下
，吸取10ml样品消化稀释液由进样口进入反应室，并以10ml水洗涤进样口使其流入反应室内 ，将400g/L NaOH溶液10ml倒入进样口
，立即夹紧螺旋夹，并加入少量蒸馏水 ，密封进样口 。

当蒸汽通入反应室时
，准确计时，反应产生的氨气通过冷凝管进入吸收瓶 ，蒸馏5min
，移动吸收瓶，使冷凝管下端离开液面 ，再蒸馏Imin
，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶
。

停止加热 ，使反应室内的液体进入汽水分离器，打开进样口的螺旋夹
，将汽水分离器的液体放出。再向反应室内加入蒸馏水，夹紧螺旋夹 ，再次进行加热至水蒸汽放出
，停止加热，使反应室内的水进入汽水分离器 ，进行洗涤 。

4 、滴定:用0.025mol/L硫酸标准溶液滴定吸收液至灰色
。

5
、计算:X= 2cVX 14X5.71/m

X为样品中蛋白质的含量
，%；c为硫酸标准溶液的浓度，molL；V为样品消化液消耗硫酸标准溶液的体积 ，ml；m为样品的质量
，g。

注意事项

(1) 样品应是均匀的 。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

(2) 样品放入定氮瓶内时 ，不要沾附颈上
。万-沾附可用少量水冲下
，以免被检样消化不完全，结果偏低。

(3) 消化时如不容易呈透明溶液 ，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢(H2O2)2-3ml
，促使氧化 。

(4) 在整个消化过程中，不要用强火
。保持和缓的沸腾 ，使火力集中在凯氏瓶底部
，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

(5)如硫酸缺少 ， 过多的硫酸钾会引起氨的损失
，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用 。因此 ，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时
，要增加硫酸的量
。

(6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂 ，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色
，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色 。如果没有溴甲酚绿 ，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液
。

(8) 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

扩展资料：

凯氏定氮法原理

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热
，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵 ，这一过程 称为有机物的消化 。

为了加速和完全有机物质的分解
，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾 、硫酸铜
、氧化汞、过氧化氢等试剂 ，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解
，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠 、氯化钾等盐类类提高沸点 ，但效果不如硫酸钾
。

硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多
，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞
、硒粉、钼酸钠等 ，但考虑到效果 、价格及环境污染等多种因素
，应用最广泛的是硫酸铜 。

参考资料：

牛奶中蛋白质含量的测定：凯氏定氮法。

凯氏定氮法介绍如下：

凯氏定氮法是由丹麦化学家凯道尔于1883年建立的，现已发展为常量
、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等 ，是分析有机化合物含氮量的常用方法
。

凯氏定氮法的理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右(12%~一19%),因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量
，假设测定物质中的氮全来自蛋白质，即:蛋白质含量=含氮量/16%。

凯氏定氮法的原理介绍如下：

蛋白质是含氮的有机化合物 。蛋白质与浓硫酸和催化剂一同加热消化 ，使蛋白质分解
，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵
。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定 ，根据酸的消耗量乘以换算系数
，并换算成蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量 。

凯氏定氮法的操作介绍如下：

向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下 ，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室
，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞
。

将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯 ，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室
，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口 ，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。

夹紧螺旋夹
，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内 ，蒸馏5min 。移动接收瓶
，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min ，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部
。取下接收瓶
，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。